LC-MS-MS如何用內(nèi)標(biāo)定量分析？

Q：本人現(xiàn)在用三重四極桿LC-MS-MS定量分析目標(biāo)物，但是沒有標(biāo)準(zhǔn)品。內(nèi)標(biāo)法該具體怎么操作呢？資料說先配制一定重量比的待測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)樣品的混合物做色譜分析，測(cè)量峰面積，做重量比和面積比的關(guān)系曲線，此曲線即為標(biāo)準(zhǔn)曲線，如果這樣的話，沒有標(biāo)準(zhǔn)品怎么辦？

方法一：

1、內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析，同樣需要待測(cè)物標(biāo)準(zhǔn)品。如果沒有待測(cè)物標(biāo)準(zhǔn)品就不能準(zhǔn)確測(cè)量其含量，因?yàn)闊o法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2、沒有待測(cè)物標(biāo)準(zhǔn)品不能準(zhǔn)確測(cè)量其含量，但可以通過加入內(nèi)標(biāo)的方法測(cè)量待測(cè)物的相對(duì)含量，可以比較待測(cè)物在各樣品中的多少及相差倍數(shù)。

3、用LC-MS-MS做定量一般都采用MRM的掃描方式，你沒有待測(cè)物標(biāo)準(zhǔn)品，就無法建立和優(yōu)化MRM掃描的質(zhì)譜參數(shù)，這樣你只能使用FULL SCAN或SIM的掃描方法。沒有待測(cè)物標(biāo)準(zhǔn)品，你也無法準(zhǔn)確得到待測(cè)物在LC上的保留時(shí)間，如果你的樣品中有與待測(cè)物相似質(zhì)量數(shù)的化合物，你得到的色譜峰就不會(huì)很純凈，會(huì)對(duì)你判定那個(gè)是你的待測(cè)化合物產(chǎn)生干擾。

方法二：沒有標(biāo)準(zhǔn)品，就只用面積相對(duì)定量。然后選用LC-MS-MS的SIM模式（樣品雜質(zhì)比較少，選擇同位素豐度為*的分子量，上下增減0.2）。考察因素導(dǎo)致的量的改變比較微量，選擇一種物質(zhì)為回收率指示物（反應(yīng)液前處理前加入），一種物質(zhì)為內(nèi)標(biāo)物（前處理后、液相小瓶中進(jìn)樣測(cè)試前，在待測(cè)樣品中加入定量的內(nèi)標(biāo)物，然后進(jìn)行測(cè)試）。

LC-MS可以進(jìn)行定量分析嗎？

Q：請(qǐng)問液質(zhì)聯(lián)用中質(zhì)譜跑出來用于定性的圖譜是什么樣的，既然是用質(zhì)譜來進(jìn)行定量的話，那色譜本身配置的紫外檢測(cè)器跑出來的圖譜用于何用？液質(zhì)聯(lián)用有SIM和全掃描的，那么一般在藥物代謝動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)中一般用哪一種呢？尤其是在對(duì)體內(nèi)藥物分析時(shí)，內(nèi)標(biāo)法用于定量的質(zhì)譜圖是什么樣的？

質(zhì)譜定量分析，使用的一般是LC-MS/MS,不使用LC-MS, 看一下質(zhì)荷比，推測(cè)下分子量。UV可以用來定量，但是在有紫外吸收的干擾峰的時(shí)候，定量是不準(zhǔn)的。LC-MS/MS使用母離子/子離子來進(jìn)行定量，相對(duì)來說，干擾要少的多，也比較準(zhǔn)確，在PK/TK的應(yīng)用很廣泛。這里只有LC-MS/MS定量的譜圖，僅供參考！

183.1/141.3 通道的是內(nèi)標(biāo)，其他的兩個(gè)是化合物。

質(zhì)譜定量中已經(jīng)被廣泛接受的方式是MS/MS定量。這種定量常通過三重四極桿或離子阱質(zhì)譜實(shí)現(xiàn)。要求使用MS/MS的原因是：許多化合物有同樣的質(zhì)量。當(dāng)使用Di一個(gè)維度即單級(jí)質(zhì)譜MS去定量時(shí)，也會(huì)缺乏特異性，尤其是對(duì)于像血液那樣的復(fù)雜的基質(zhì)。Di二個(gè)維度的MS（即MS/MS）在大多數(shù)情況下，能夠提供wei一的斷裂。合并特異的母離子質(zhì)量和wei一的碎片離子信息，可以選擇性地監(jiān)測(cè)被定量的化合物。

LC-MS-MS定量分析實(shí)例

用LC-Q-TOF-MS 來做代謝組學(xué)，因?yàn)槭菢悠肥求w液含有多種化合物，想加入內(nèi)標(biāo)后先進(jìn)行一個(gè)相對(duì)的定量來判斷含量發(fā)生變化的化合物，怎樣去定量？用總離子流圖好像不合適，如果利用峰面積進(jìn)行相對(duì)定量的話，用哪個(gè)圖比較合適？得用標(biāo)準(zhǔn)品才能定性嗎？

LC-MS-MS定量分析使用SIM 或MRM模式。*的MRM更為準(zhǔn)確。SIM使用Q選擇性的濾過選中的分子量。但是分子量相同的化合物很多，所以，如果樣品稍微復(fù)雜的話，SIM基本不合適。

MRM選擇母離子和子離子。使用Q過濾母離子，q 轟擊母離子，TOF過濾子離子，使子離子被檢測(cè)器檢測(cè)到。分子量相同，轟擊后產(chǎn)生的子離子不一樣的干擾離子就被排除了。所以，MRM模式是更為可靠的LC-MS定量分析方法。MRM檢測(cè)是離子對(duì)。

內(nèi)標(biāo)的選擇原理是結(jié)構(gòu)基本和待測(cè)化合物類似。結(jié)構(gòu)相同或類似，主要是為了滿足被離子化的效率與樣品類似。這就是為什么很多都選擇使用該化合物或此類化合物的氘代化合物。內(nèi)標(biāo)的選擇還要求其分子量與待測(cè)物質(zhì)不重合（還需要盡量避開化合物的isotopic peak的m/z），并且可以和待測(cè)物質(zhì)分開。

如果使用MRM, 樣品被分開的話，那么理論上來說總離子流圖上的每個(gè)峰都是代表一種物質(zhì)。同時(shí)使用MRM模式，如果樣品們的分子量與子離子不重疊，那么，即使在柱子中不被分開的化合物，也是可以認(rèn)為在MS中被分開了。

液質(zhì)中幾個(gè)峰，MRM檢測(cè)到幾十個(gè)物質(zhì)就是多個(gè)物質(zhì)在同一時(shí)間從色譜柱跑出來了。雖然出峰時(shí)間一樣，但是每個(gè)化合物的peak應(yīng)該是軟件中可以顯示出來的，只不過報(bào)道中由于篇幅有限，會(huì)被簡(jiǎn)略掉。

定性的話，需要標(biāo)品，retention time 需要一致。

定量的話，需要先作標(biāo)準(zhǔn)曲線。